Formation en PCR quantitative

Journée 1 : 8h45 – 9h00 : Accueil des participants

9h00 : Début de formation
9h00 – 9h30 : tour de table, présentation ds auditeurs et de la formatrice
9h30 – 12h30 PCR quantitative : Aspect théorique

Analyse de la courbe de dissociation (melting curve analysis)

Définition du TM

Spécificité de séquence et TM de l’amplicon – Contaminations

Dimères d’amorces

Qualité et validation de la PCR

Etude de la cinétique d'amplification

Identification et propriétés mathématiques de la phase exponentielle – Bruit de fond des fluorophores

Seuil de détection (Cp/Ct/Cq)

Efficacité de la PCR

Définition et utilité E=10 -1/pente

Calcul de l’efficacité par régression linéaire d’une gamme de dilution

Validation des amorces : dynamique, linéarité et limite de détection

Standardisation et validation des manipulations de PCRQ (intra et inter-run) – Les contrôles indispensables

12h30 : Déjeuner

14h00 – Quantification par PCR en temps réel

ARN et ADN génomique

Quantification absolue

Quantification relative – Avec et sans correction d’efficacité (2ddCT) – Stratégie de quantification en fonction du contexte biologique

Stratégie de normalisation

Définition des gènes de référence (housekeeping gene)

Choix et validation des gènes de référence : moyenne arithmétique ou géométrique ? – Les outils gratuits à connaître (Genorm, Bestkeeper)

Journée 2 : 8h45 – 9h00 Accueil des participants

9h00 : Début de formation

Les résultats

La reproductibilité

La sensibilité

La précision (exact /relatif)

Les réplicats techniques et biologiques

Présentation des résultats : Nombre de copies, comparatif, fold change, fold increase – Quelques logiciels à connaître ou paramétrer Excel ?

Publication et PCRQ : Les MIQE validation des microarray et PCRQ haut débit – TLDA-Nanostring différentes approches du génotypage ou polymorphisme en PCRQ

Les sondes d’hybridation

La PCR digitale

Le HRM (High Resolution Melt Analysis)

12h30 : Déjeuner

Dessin des amorces de PCRQ STRATÉGIE EFFICACE DE DESIGN EN 5 ÉTAPES FACILES : – HUGO nomenclature du gène – ENSEMBL : connaître son gène pour définir la séquence à amplifier – Organisation intron exon ; séquences codantes,UTR ; isoformes – Logiciels et outils de design – Beacon designer : pourquoi c’est le meilleur .BLAST et MFOLD Les paramètres à spécifier pour les amorces et les amplicons – UPL de Roche – Les banques d’oligonucléotides – Amplify : la PCR électronique très prédictive et gratuite – Commande, test et validation des oligos

17h00 : Fin de formation

Journée 3 : 8h45 – 9h00 Accueil des participants 9h00 : Début de formation PCR Quantitative : aspect pratique

Précautions et risques biologiques mise en place d'un projet de quantification : les points à considérer

Les équipements : Thermocycleurs, circuit PCR, nanodrop, bio analyseur, les consommables, les kits

Protocoles et optimisation échantillons, ARN, CDNA, ADN : nature, qualité, extraction, quantification, conservation

La reverse transcription : Une étape clé à optimiser en permanence

Quantité ARN

Le traitement à la Dnase

Les différentes enzymes

La stratégie d’amorçage et sensibilité détection
(oligotDT random primers ou amorce spécifique)

Rendement de la RT et vérification

Les contrôles de RT

Les kits de RT

Le CDNA

Détecter les inhibitions de la PCR

Les amorces

La gamme d'étalonnage

Les contaminations et cross contamination

12h30 : Déjeuner

Analyse et Exploitation des résultats

Programmation des runs

Présentation du logiciel du STEPONE PLUS

Analyse des runs – Savoir identifier les erreurs

Le piège des (mauvais) algorithmes de détection du seuil calcul et exploitation des résultats dans Excel

Présentation d’outils gratuits pour les calculs ou la normalisation : REST, BESTKEEPER

Présentation d'outils bio-informatiques pour le design des amorces : HUGO, ENSEMBL, BLAST, UPL, PRIMER BLAST, AMPLIFY etc. Bibliographie

16h00 : Tour de table, échange avec le formateur 16h15 : Evaluation des compétences par questionnaire 16h30 : Evaluation de la formation par les auditeurs

17h00 : Fin de formation